盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度常见问题及处理方法

现代农业科技２０１２年第１７期　农艺学　盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度常见问题及处理方法　师范生　（山西省运城市种子管理站，山西运城０４４０９０）　摘要介绍了盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度常见问题及处理方法，以期为玉米种子纯度鉴定提供参考。　关键词盐溶蛋白电泳法；玉米种子；纯度鉴定；常见问题；处理方法　中图分类号￥３３９．３１；￥５１３　文献标识码Ｂ　文章编号１００７—５７３９（２０１２）１７—００６９一Ｏ１　盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度是基于品种间种子　子，注意如果两端梳子齿已抬起而中部梳子齿未抬起时，不　贮藏蛋白中盐溶蛋白质的组分差异来鉴定玉米种子纯度【１】。　从玉米种子中提取出的盐溶蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳的　浓缩效应、分子筛效应、电荷效应作用下得到分离，通过染　色显示系列蛋白质谱带根据谱带差异情况鉴定玉米种子的　真实性和品种纯度。该方法快速准确、经济实用，于２００１年　被列为行业标准。该标准是我国第一部利用种子贮藏蛋白　电泳技术鉴定玉米种子纯度的行业标准。标准的实施为我　国玉米种子室内纯度鉴定提供了重要的手段．在玉米种子　纯度检验工作中得到了广泛的应用。笔者结合工作实践总　结在实际使用该标准中可能遇见的问题及处理建议，以供　同行们商榷。　１凝胶液不凝或者聚合缓慢不能形成胶体　如果在胶液中加入催化剂过氧化氢后，凝胶液不凝或　聚合缓慢不能形成胶体，可能由以下几个原因造成：一是药　品纯度不够；二是试剂配比不当；三是胶液过期；四是催化　剂失效。在实际操作中，常常会碰到分离胶能够聚合，而浓　缩胶不能聚合成胶体的情况，这是因为浓缩胶对试剂纯度　的要求比分离胶液更高，若出现该种情况。首先，要特别注　意Ｎ，Ｎ一亚甲基甲叉双丙烯酰胺的纯度和保质期，要求其纯　度最好是９９．０％以上的分析纯；其次，由于抗坏血酸不稳定，　极易分解，因此在胶液中可适当增大抗坏血酸的比例至标　准中的１．５倍或２．０倍。可促进胶液聚合，并可有效延长胶　液的保存期３０～４０ｄ。　。　２点样孔破裂较多　从浓缩胶中拔出样品梳时，点样孔破裂较多，会使试验　终止。这是应用电泳法检测种子纯度最常发生的情况，可能　有以下几种原因，一是样品梳齿厚度不合适；二是催化剂过　氧化氢的用量不合适；三是凝胶聚合的时间不够；四是拔梳　子时用力不均，方式不对。通常在进行该步操作时，首先，要　仔细检查样品梳齿的厚度与两玻璃板狭槽是否合适，不能　过紧，要稍微有一点空隙为宜，否则凝胶聚合后．很难拔出。　其次，催化剂的用量要合适，量少聚合时间长．量多聚合太　快，最好先进行预试验，确定催化剂的用量及聚合时间再倒　胶，按经验，通常５　ｍＬ的浓缩胶液加入５－６　Ｌ的３％过氧　化氢，聚合４～５　ａｒｉｎ，再拔出梳子较适宜。再次，拔梳子时，把　短玻璃面朝向自己，双手平放在梳子的近两端处，两手均匀　用力，先前后稍微平晃一下梳子。再把手放在梳子中部，前　后稍微平晃一下梳子，造成梳子整体松动，然后两手先放在　梳子近两端处向左右稍拉紧梳子同时再缓慢向上抬起梳　收稿日期２０１２—０６—２５　能再向上抬，可把两手平放在近中部，稍倾斜往自己怀里方　向缓抬，使中部梳子齿抬起，最后再把手放在梳子近两端处　缓慢向上抬起，同时稍往自己怀里方向晃动，一次性拔出　梳子，即可获得较满意的点样孔。　３凝胶粘板　电泳后，从２块玻璃板中取出凝胶时，常会出现凝胶粘　板不好剥离的情况。产生的原因通常：一是玻璃板清洗的不　干净或有划痕。因此，在清洗玻璃板时，一定要仔细，先用软　毛刷小心刷洗玻璃板两面，并在蒸馏水中浸泡然后放在玻　璃架上自然晾干或烘干。二是取凝胶时温度较高。一般电泳　完成后，玻璃板还很热，如果马上卸板取出凝胶就容易出现　凝胶粘板不好剥离的情况。通常从胶条上取出玻璃板后稍　放置一段时间，让凝胶冷却或用冷水冲玻璃板两面散发凝　胶热量再卸板。也可把取下的玻璃板直接放在冷水中，通过　热胀冷缩效应使玻璃板与凝胶分离再进行卸胶。　４蛋白质谱带问题　４．１蛋白质谱带较少或样品间普带宽窄及着色深浅不一　凝胶染色后，有的样品蛋白质谱带较少或样品间谱带宽　窄及着色深浅差别较大，产生原因可能是样品制作上不规范　造成阁。一是注意样品的磨碎程度要均匀一致，颗粒不宜过　粗或过细。二是粉碎的样品装入离心管时，种子胚不能丢失，　因为种子胚内有大部分盐溶蛋白，胚丢失会造成蛋白谱带　严重缺少。三是离心管内所装的种子颗粒以半管为宜，不宜　过多，否则提取液过少，造成某些蛋白未能提取出，致使某　些蛋白谱带丢失。四是样品加入提取液后在室温放置时要　充分摇匀，同时注意提前时间不宜过长，以防部分蛋白质降　解，造成蛋白谱带缺失，一般放置３０～４０ｍｉｎ即可进行点样。　４．２谱带弯曲　如果染色后，有些部位蛋白谱带弯曲，可能是分离胶中　加入过氧化氢时，过氧化氢分布不均匀，使得凝胶聚合不　均，造成蛋白谱带弯曲嘲。在倒分离胶时，加入过氧化氢后要　充分摇匀保证胶液均匀一致并注意不要有气泡再倒胶。还　有可能是电泳时，电极缓冲液温度过高或凝胶液及电极缓　冲液ｐＨ值不准确，改变了电泳系统的电阻，一般会使分子　量小的蛋白谱带弯曲，可以通过接入冷却水的方法降低电　极缓冲液的温度，另外在倒胶和加入电极缓冲液时测一下　ｐＨ值，并用乳酸调整到准确时再进行电泳。　４．３蛋白谱带模糊不清　凝胶染色后，发现蛋白谱带模糊不清，可能由以下原因　（下转第７２页）　６９　农艺学　严惩。确保生产用种安全。　２．５文明执法。把好销售行为关　现代农业科技２０１２年第１７期　２．６认真对待群众来信来访或投诉、举报案件。把好纠纷调　解和案件查处关　依法对种子市场进行监督检查，一是不定期采取地毯　式检查，不留死角；二是重点地区、重点季节、较大的种子经　营门店采取巡回检查，加大日常巡查频率，认真作好巡查记　录；三是联合工商、综合执法大队等部门，发挥合作优势，形　成执法合力，以种子执法年活动和农资打假专项整治为契　机，日常监管与突击检查相结合，对辖区内种子市场进行清　理整顿和专项整治嗍；四是按照“教育为主、处罚为辅，以人　为本、文明执法”的执法理念，对检查中发现的违反种子市　随着对国家惠农政策的深入宣传和法律法规的普及．　农资打假投诉电话１２３１６和１２３１５向社会公布后。农民因　种子质量问题的投诉逐年增多，管理站应认真对待群众来　信来访或投诉、举报案件，妥善处理种子纠纷案件，做到件　件有回音、事事有结果。目前，罗平县种子案件投诉一是自　然灾害造成的事故，二是由于技术过失引起的事故【５】，三是　“套牌种子”引起的种子纠纷。实行首问责任制，积极做好上　访或投诉、举报案件的登记、核实、调查和鉴定工作，深入调　查研究，依法及时、客观、公正地调解种子质量纠纷，维护种　场秩序的各种违法行为，做到及时发现及时纠正，责令并监　督、指导其改正，对屡教不改的坚决依法查处。通过对案件　的查处，起到查处一案、教育一片的作用。　２０１０－－２０１２年，以种子执法年活动为契机，制定《罗平　子生产者、经营者和使用者的合法权益，维护农村社会稳　定，对违法行为进行查处，并把查处结果向上访群众或举　报人反馈。５年共接待群众来信来访超过１３０人次，处理种　县种子执法年活动方案》，成立了以罗平县农业局局长为组　长、副局长为副组长的种子执法年活动领导小组。从种子管　理站、法规科和综合执法大队抽调种子检验员、执法人员和　子纠纷案件超过８０起。通过实地调查、取样分析、室内检测　等措施，充分发挥管理站多专业的优势，综合分析，作出科　学合理的结论，提出及时补救措施，最大限度地减少了损　失。及时核查省市批转案件。按通知要求认真进行实地核　车辆，组成种子执法专项检查工作组，由副局长带队，联合　工商等相关部门。对全县种子市场进行为期１个月的现场　检查和种子质量抽查。检查组一查是否取得种子经营备案　查。形成书面材料，并及时将核查或处理情况向市站和县　农业局汇报，并将核查情况在罗平县农业信息网上公布。　２．７积极开展新品种试验研究。为品种审定和品种准入提　供理论依据　书和种子经营从业人员合格证．二查是否建立健全种子经　营档案［４１，三查标签标注是否规范，四查品种是否符合准入　要求，五查是否存在经营假劣种子行为。　市场监督检查发现部分种子代销商存在违反种子经营　自２００７年以来共组织实施国家、省、市安排和相关育　种单位委托的玉米、水稻、油菜等作物新品种试验８２组１　０５３　个品种，其中，油菜新品种３０组４２０个组合，玉米新品种　（组合）２８组３８６个组合，水稻新品种（组合）２４组２４７个　（组合）。通过对上述新品种（组合）试验研究，为品种审定和　品种准入提供理论依据。现经过国家、省、市品种审定委员　会审定通过的品种有１６６个。　３参考文献　Ｉ１］李景荣．对加强沧源县种子管理工作的思考［Ｊ】．云南农业，２００５（３）：　２２－２３．　秩序的违法行为，管理站要及时发现及时纠正，积极依法采　取相应的措施。对未按规定取得种子经营备案书和种子经　营合格证的，按相关规定发出《责令改正通知书》，井督促种　子代销户在规定时限内及时到种子管理站补办种子经营备　案书和种子经营合格证；对未按规定建立健全种子经营档案　的，采取当场给予口头教育或按相关规定发出《责令改正通　知书》，并督促种子代销户及时改正和在规定时限内按要求　把经销的品种和数量填报并来管理站备案；对经销的品种不　符合准入要求的，依据《种子法》《云南省农作物种子条例》　和相关文件规定，分别发出《责令改正通知书》《停止销售通　知书》，督促种子代销户限期退种处理，并要求供种方招回；　对标签标注不规范的．及时上报市种子管理站，由省市管理　站在恰当的时机统一向种子企业通报，并要求逐步改进。　（上接第６９页）　［２】王党才．丘北县种子市场存在的问题与对策【ＪＪ．云南农业，２００９（１）：　３０７—３０８．　【３资菊丽，蔡成向．３１如何通过种子检验提高玉米制种质量【ＪＪ．云南农业，　２００８（１）：１８１－１８２．　【４Ｊ段智辉．种子行业为大灾之年夺丰收提供源头保障【Ｊ］．云南农业，　２００８（１）：１８６—１８７．　［５】刘广和，代丽娅，马云珠，等．如何预防种子事故发生【ＪＪ．云南农业，　２００９（１）：３０３—３０４．　极缓冲液的温度。四是样品提取时，放置时间过短或过长。　染色后也会造成蛋白谱带模糊不清。样品提取时放置时间　过短．蛋白没有提取出或含量较少；放置时间过长，提取的　蛋白会部分降解，此２种情况均会导致染色后蛋白谱带模　糊不清或谱带缺失。一般提取时间在３Ｏ～５０　ｍｉｎ较适宜。染　色后蛋白谱带清晰，分辨率高。　５参考文献　…１王玺，张宝石．玉米种子纯度鉴定技术研究进展【ＪＪ．种子，２００２（１）：　４３—４５．　产生：一是凝胶液或样品提取液存放时间过长，使得某些不　稳定试剂挥发或失效，造成凝胶染色后蛋白谱带模糊不清，　可考虑重新配制试剂并缩短使用期嗍。二是染色液使用次数　较多，使得各成分比例不当，染色后会导致蛋白谱带模糊　不清。染色液用过１次后。三氯乙酸会有挥发以及考马斯亮　蓝会结合在凝胶中的蛋白上，因此下次再使用时要适当添　加三氯乙酸和染色液。一般每２００　ｍＬ染色液，下次再使用　时可适当添加５～７　ｍＬ的染色原液和５０　ｍＬ的三氯乙酸。三　【２］闰米格，许晶，骈跃斌，等．玉米种子纯度鉴定中ＤＮＡ提取方法的比　较研究［Ｊ】．山东农业科学，２０１１（９）：７－８，１４．　【３］刘景云．玉米种子纯度鉴定方法们．现代农业科技，２０１１（３）：１０３—１０４．　［４］罗长安，周本义，蔚世林，等．蛋白质凝胶电泳技术在玉米种子纯度鉴　定中的应用叨．种子科技，２００７，２５（２）：４１—４３．　是电泳时电极缓冲液温度过高或ｐＨ值不准确。导致电泳速　度过快。染色后蛋白谱带变宽，模糊不清，甚至弯曲。电泳前　要准确调整电极缓冲液ｐＨ值。并通过连接冷却水来降低电　７２