干货分享 | 采用 qRT-PCR 检测细胞炎性因子
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发布时间:2025-01-16 22:22
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时间:2025-01-16 22:26
qRT-PCR 技术简介
qPCR 技术通过特异性扩增 DNA 序列,并利用荧光探针或 SYBR Green I 检测 PCR 产物数量,实现对样品中目标序列的定量分析。该技术具备快速、准确、高灵敏度和高特异性等优点。
qRT-PCR 应用领域
qRT-PCR 技术广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等多个领域,成为科学研究中不可或缺的定量工具。
实验材料与仪器
实验所需材料与仪器包括 RNA 提取试剂盒、反转录试剂、qRT-PCR 试剂盒、细胞炎性因子引物或探针(根据方法不同)、PBS、DEPC 水等。此外,还需要 EP 管、八连排 PCR 管、无 RNA 酶的头等实验室耗材。
实验步骤
1. 细胞培养:在培养皿中接种待检测细胞,处理细胞,然后用 PBS 清洗以去除干扰。2. RNA 提取:提取细胞中的总 RNA,使用紫外分光光度计检测 RNA 浓度与纯度。确保 A260/A280 比值在 1.8~2.1 之间。RNA 稳定性差,提取后应立即进行反转录反应。3. cDNA 合成:去除基因组 DNA,通过反转录反应获取 cDNA。保存 cDNA 至-80℃备用。4. qRT-PCR 反应:设计特异性引物,以 cDNA 为模板进行 qRT-PCR 扩增反应。分析扩增曲线和融解曲线,构建标准曲线。5. 数据分析:使用 qRT-PCR 仪检测荧光信号,计算细胞炎性因子的表达水平,以β-actin 作为内参基因,采用 2-△△CT 法进行计算。
注意事项
1. RNA 提取:RNA 提取的质量与纯度直接影响后续实验。使用高质量的 RNA 提取试剂盒,严格遵循操作步骤,防止 RNA 降解与污染。2. cDNA 合成:选择合适的逆转录酶、引物及反应条件。反转录前,进行 DNA 酶消化,避免 DNA 污染。3. 引物与探针设计:设计特异性引物和荧光探针以准确扩增目标序列,减少假阳性风险。使用在线工具设计或购买商家提供的引物和探针。4. SYBR Green 法:根据 PCR 仪器型号,选择是否加入 ROX 染料。5. 数据分析:使用专用软件处理数据,进行标准化和统计学分析。确保实验结果的可靠性,重复实验进行验证。